Proteinas K: egenskaper, enzymatisk aktivitet och applikationer

Proteinas K är ett enzym som hör till gruppen av serinproteaser, det vill säga det har vid sitt aktiva katalytiska centrum en aminosyra serin och har funktionen att bryta peptidbindningar genom hydrolys. Detta enzym hör i sin tur till familjen av subtilisinproteiner (peptidas S8).

Proteinas K har en molekylvikt (MW) på 28 900 dalton och isolerades för första gången 1974 från extrakt av svamp Engyodontium-albumet, tidigare känt som Tritirachium-album Limber.

Det uppvisar en hög proteolytisk kapacitet, som demonstreras för att kunna försämra det närvarande keratinet i håret. Ordet keratin på engelska är skrivet "keratin", varför det har kallats "proteinas K".

På grund av sin höga kapacitet att klyva in native proteiner är detta enzym användbart i olika molekylärbiologitekniker. Det används huvudsakligen för att isolera och förbereda nukleinsyror med hög molekylvikt (MW).

Proteinas K verkar genom att frigöra nukleär DNA, samtidigt som proteinerna förstörs och inaktiveras RNaser och DNaser, det vill säga eliminerar nukleaserna i DNA- och RNA-beredningarna.

Å andra sidan har det visat sig att proteinas K kan hydrolysera vissa denaturerade nativa proteiner, vilket har väckt intresse för forskare för dess användning vid studien av prionproteiner (PrP C).

Trots dess höga proteolytiska potens finns det proteiner som är resistenta mot proteinas K-verkan. Bland dessa finns några onormala proteiner som kallas prions (PrP Sc), associerade med transmissibel spongiform encefalopati.

Egenskaper hos proteinas K

Proteinas K har en tertiär struktur bildad av tre skikt, med ett p-ark med sju kedjor mellan varandra skilda mellan två skikt av spiraler. Eftersom den tillhör S8-peptidasfamiljen kännetecknas den av att den har en katalytisk triad i sin aktiva plats, vars sekventiella ordning är (Asp, His och Ser), som skiljer dem från andra peptidasfamiljer.

Detta enzym från gruppen av serinproteaser karakteriseras genom hydrolysering av peptidbindningarna nära karboxylgruppen i de alifatiska och aromatiska aminosyrorna.

Å andra sidan kan den verka i närvaro av vissa frätande ämnen, såsom natriumdodecylsulfat (SDS), Tris-HCL och EDTA, som används för att hjälpa till att denaturera proteiner, vilket får dem att förlora sin ursprungliga struktur.

Detta är ett preliminärt steg vid framställning av proteiner för elektrofores-tekniken. PH-intervallet vid vilket proteinas K verkar är ganska bred (2, 0 till 12, 0), med ett optimalt pH mellan 7, 5 och 12, 0 och dess isoelektriska punkt är 8, 9. Som kan ses är den aktiv mot ett mycket brett spektrum av pH.

En annan egenskap som sticker ut i proteinas K är dess stabilitet i närvaro av höga temperaturer (50-60 ° C).

Enzymatisk aktivitet

Proteinas K behöver närvaron av kalciumjon, även om detta inte påverkar dess aktivitet om det är nödvändigt att bibehålla stabiliteten.

För att proteaset K ska utföra fullständig digestion av substratet är en approximativ kontakttid på mellan 5 minuter och 2 timmar nödvändig.

I detta avseende jämförde Daza et al. Jämfört med renheten hos det DNA som erhölls vid olika tidpunkter för exponering för proteinas K, och drog slutsatsen att en långvarig inkubation (upp till 24 h) signifikant förbättrar DNA-kvaliteten.

Nu, i förhållande till koncentrationen som används av enzymet proteinas K i de olika protokollen kan det sägas att det är mycket varierat.

Den kan användas från mycket låga koncentrationer (5 μg / ml) till koncentrationer av 500 μg / ml. Men de vanligaste arbetskoncentrationerna varierar mellan 50-100 μg / ml, speciellt för proteindeltning och nukleasinaktivering. Även om en koncentration på 2 mg / ml krävs för vävnadsbehandling.

tillämpningar

Dess tillämpningar är mycket breda och kan sammanfattas i följande:

-Det används vid uppslutning av proteiner och DNA-extraktion genom flera metoder såsom saltning, PK-SDS, cetyltrimetylammoniumbromid (CTAB), modifierat kaliumacetat och extraktion med natriumjodid.

-Innaktivering av nukleaser (RNaser och DNaser).

-I tekniken för in situ- hybridisering (HIS), för att hjälpa till med frisättning av nukleinsyra, förutom att eliminera oönskade proteiner.

-Modifiering av proteiner.

- På forskarnivå, i olika studier.

Fördelar med proteinas K

Flera jämförande studier har gjorts bland DNA-extraktionstekniker med Proteinase K, med andra som inte använder det och alla slutsatsen att det finns större fördelar vid användning av enzymet. Bland fördelarna kan följande nämnas:

- DNA med hög molekylvikt, hög kvalitet och renhet erhålles.

-Den extraherade DNA är stabil i upp till 3 månader.

Det extraherade DNA kan användas i följande tekniker: Southern blot, polymeras kedjereaktion (PCR), elektrofores, bland andra.

Proteiner som är resistenta mot proteinas K

Flera undersökningar har dragit slutsatsen att prioner (onormala PrPSc-toxiska proteiner) differentieras från PrPC-proteiner (infödda) eftersom de är resistenta mot proteinas K-verkan, medan PrPC är känsliga för deras verkan.

Andra författare har beskrivit att i strukturen av PrPSc finns känsliga delar och andra resistenta mot proteinas K. Båda delarna är emellertid lika giftiga och infektiva.

Å andra sidan isolerade Bastian och medarbetare 1987 4 proteiner med 28, 30, 66 och 76 kda från en art av Spiroplasma mirum . Alla var resistenta mot verkan av proteinas K och korsreagerades även med vissa prioner.

Det är känt att denna art kan orsaka grå starr och viktiga neurologiska skador och på grund av de vetenskapliga resultaten av Bastian bland andra utredningar har ett försök gjorts för att relatera denna mikroorganism till transmissibel spongiform encefalopati.

Emellertid tillskrives etiologin för denna degenerativa neurologiska patologi fortfarande prioner.

I denna mening identifierade Butler och medarbetare 1991 och karakteriserade en klass av 40 Kda proteinasresistent protein från två stammar av Mycoplasma hyorinis. Denna patogen påverkar grisar, infekterar deras vävnader, men i detta fall fanns ingen korsreaktion med de testade prionerna.

Mer forskning behövs för att belysa många okända om det.